Протокол отбора образцов

Протокол отбора образцов водной среды, беспозвоночных животных и растений для микробиологических и генетических исследований.

Единый стандартизированный протокол отбора образцов необходим для возможности использования образцов различными группами исследователей, сравнения результатов, полученных в разное время или при разных условиях, повторного отбора образцов из того же местообитания. Помимо собственно образца биологического материала (живые или фиксированные клетки, образцы ДНК и т.д.) каждый образец должен сопровождаться так называемыми метаданными – любой сопутствующей образцу информацией. В первую очередь метаданные включают: (1) максимально возможную характеристику места и времени отбора образца; (2) характеристику самого образца, учитывая его особенности; (3) специфические условия отбора, связанные с дальнейшим использованием образца.

Точные дата и время отбора образца необходимы для выявления возможных корреляций состава исследуемого микробного сообщества с временем года и суток, а также с другими процессами, происходившими в это время.

Обозначение типа отобранного образца необходимо для дальнейшей кластеризации образцов по группам (животное, растение, гриб, почва, грунт, вода, осадки), а также для сравнения полученных результатов как внутри группы, так и между группами. Особое значение имеет отбор контрольных образцов из того же местообитания и в то же время (например, при исследовании микробного или грибного сообщества, ассоциированного с беспозвоночным животным или растением, для сравнения обязательно используется образец близлежащего грунта/почвы). Для каждого типа образцов применяются свои правила отбора и набор необходимых характеристик.

Полная характеристика места отбора образца необходима для возможного повторного отбора пробы из того же местообитания, а также для выявления возможной корреляции состава и свойств микробного сообщества с параметрами окружающей среды. Все полученные характеристики места отбора пробы вносятся в соответствующую таблицу (Приложение 2).

Образцы почвы, грунтов, донных отложений отбирают с помощью любых удобных для этого инструментов (совков, черпаков, трубок и т.д.), пробы воды с глубины – с помощью батометра. Образцы бентосных и почвенных беспозвоночных животных, в зависимости от размеров, выбирают из образцов грунта или из трала после отмывки от грунта морской водой с помощью пинцета или шпателя. Образцы водорослей и планктонных животных собирают с помощью планктонной сетки и разбирают таким же образом. Емкостями для сбора природных образцов служат стерильные 15 и 50 мл пробирки, пустые или частично заполненные водой из того же местообитания.

Особи беспозвоночных животных определяют до вида с помощью определителей и проверяют валидность вида по современным статьям и международной базе данных морских организмов (www.marinespecies.org). Далее животное фотографируют и регистрируют в музейной коллекции (беломорский филиал Зоологического музея МГУ) с присвоением индивидуального номера. Перед манипуляциями живые особи помещаются в стерильную морскую воду  (профильтрованную через фильтр с размером ячеи 0.22 мкм) на 12-24 часа для отмывки. При необходимости животных расслабляют с помощью изотоничного раствора MgCl₂. Для выделения необходимых участков тела (кишки, покровов и тп) производится препарирование животного в стерильной морской воде в стерилизованных спиртом ванночках для вскрытия с помощь пинцетов и преправильных ножниц. Нужные участки помещаются в фиксирующую жидкость в стерильные пробирки 1.5 мл. 

Макроводоросли собирают в виде целого таллома, по возможности с местом прикрепления и ризоидами. Свежий образец отмывают водой (соленой для морских видов) от обрастателей, в первую очередь беспозвоночных, что особенно важно для красных водорослей. Из образца делается гербарий и параллельно фиксируют этанолом, раствором люголя или фосфатным буфером. Для поддержания живого состояния вместе с кусочком субстрата помещают в аквариум с аэрацией, освещением температурой и соленостью воду близкой к естественным. Для пресноводных макрофитов используются колбы с ватной пробкой, жидкой средой, освещением и аэрацией.

Микроводоросли следует определять в живом состояние не позднее 3-4 часов с момента сбора (в противном случае, беспозвоночные используют их в качестве пищи, состав будет искажен или истреблен, а подвижные формы могут перейти в состояние покоя и определение будет затруднено). Образец помещают в стерильную колбу с жидкой средой, для пресноводных водорослей это обычно вода с микроэлементами.

Почвенные микроводоросли отбирают вместе с субстратом, помещают в стерильную влажную камеру и хранят при 4^оC.

Симбиотические микроводоросли собирают вместе с хозяином (например лишайник, гриб или сфагнум) и в живом состояние помещают на агаризованную питательную среду, либо хранят в качестве гербарного образца.

Определение водорослей ведется по определителям и уточняется по электронным базам данных (например, AlgaeBase).

Микробиом и ассоцированные с растением грибы исследуют для растений, произрастающих как в естественной среде, так и в оранжерейных условиях (для тропических видов, культивируемых в условиях умеренного климата). Дикорастущее растение фотографируют в нескольких ракурсах, и сразу или по возможности определяют до вида с выверкой номенклатуры по международным базам данных. Для растений, выращиваемых в ботанических садах, получают имеющуюся информацию по условиям культивирования: субстрату, особенностям полива, освещенности, влажности и т.д.

В эксперименте используют сосудистые растения старше 1 года жизни (для многолетних растений), без каких-либо визуальных признаков повреждений или патогенных инфекций (если это не является предметом исследования). С одного растения отбирают не более 3-5 листьев или корней (в зависимости от вида) для получения усреднённого образца, после чего растение возвращают в исходную среду. Исследуют не менее трёх растений одного вида, располагающихся в максимальной близости друг от друга, для нивелирования возможного влияния абиотических или биотических внешних факторов на состав их микробиома.

Фитомикробиом одного растения изучают на примере его филлопланы и ризопланы. Для этого с травянистых или древесных растений асептически (с использованием стерильных или протёртых этиловым спиртом пинцетов, скальпелей, ножниц) отбирают (срезают) полностью у основания листья (для изучения микробных сообществ филлопланы) и корни (для изучения микробных сообществ ризопланы), как максимально разнообразно и количественно заселённые области в растительно-микробных консорциумах, наиболее полно отражающие присущее растению фитомикробиом. В качестве дополнительной возможности изучения локализации и динамики распределения микроорганизмов возможен отбор вегетативных почек (для кустарников и древесных растений), а также побегов (повторность отбора – пятикратная).

Биоматериал (листья, корни, почки) помещают в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 мл. Желательно проводить анализ в тот же день, либо пробирки хранят при температуре 4^оС (при необходимости выделения культивируемых микроорганизмов) не более 24 ч.

Затем листья и корни очищают механически от частиц субстрата и асептически взвешивают, после чего навески отмывают в стерильной водопроводной воде, для чего помещают в конические колбы на шейкер (100-180 об/мин) в течение 10 минут для удаления транзиторных микроорганизмов. Затем усреднённые навески в зависимости от растения и целей эксперимента делят на несколько частей: i) для выделения культивируемых микроорганизмов на питательной среде (например, R2A); ii) для поверхностной стерилизации с целью изучения состава эндофитных микроорганизмов, колонизирующих внутренние ткани растений;  iii) для выделения ДНК и последующего  молекулярно-генетического анализа микробиома.

С целью сравнительного анализа состава микробиома собственно растения и  микробного сообщества окружающей среды исследуют также субстрат (почву), в котором произрастает изучаемое растение. Для этого стерильным шпателем (можно также использовать скальпель или пинцет) отбирают субстрат из трёх-пяти участков, располагающихся в непосредственной близости от произрастания растения, но не представляющего ризосферную почву (область 0.5-1 см от корней). Если объектом исследования является микробиом ризосферной почвы, необходимо провести соответствующий отбор образцов. Субстрат помещают в стерильные пробирки с закручивающимися крышками (хранят также, как и другие образцы).

Отбор анализируемого слоя осадка может осуществляться с помощью различных устройств:

• дночерпателя или драги (отбор происходит с нарушением стратификации донных отложений);
• стратиметров, трубок, мультикореров (отбор происходит без нарушения стратификации донных отложений).

Отбор образца осадков непосредственно для анализа осуществляется при помощи шпателя из поднятого на борт плавсредства или на берег анализируемого слоя осадка. Образцы отбирают в стерильные стеклянные или пластиковые флаконы объемом не менее 5 мл, с герметичной крышкой. Подготовленный образец осадка должен быть освобожден от растительных и животных остатков. Дается описание осадка, его цвета, структуры, наличия неразложившейся органики, запаха (если есть). Хранение и транспортировка флакона должна осуществляться при температуре от 2 до 8 °С.

Образцы для микробиологических и микологических исследований отбираются стерильными шпателями или пипетками в 15 или 50 мл пластиковые или стеклянные флаконы. Если образцы, предназначены для анаэробного культивирования, флаконы или пробирки заполняются полностью и герметично закрываются, в случае аэробного культивирования оставляется свободный объем до 50%. Хранение в течение нескольких дней (до недели) при температуре окружающей среды, более долгое хранение – при 4^оС. 

Пробы для молекулярно-биологических и генетических исследований отбирают в 0.5-5мл стерильные пластиковые флаконы. Для фиксации образца во флакон добавляют фиксирующий буфер А следующего состава:

• 100мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА);
• 100мМ трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Трис-НCl), рН 8.0;
• 150 мМ натриевой соли соляной кислоты (NaCl).

Все компоненты буфера должны быть стерильны, иметь чистоту не менее 99.9%, быть свободными от контаминаций ДНК и РНК, быть свободными от ДНКазной и РНКазной активности. Буфер добавляется таким образом, чтобы весь объем образца был в него погружен. После фиксации буфером А дальнейшее хранение и транспортировка образцов осуществляется при температуре 4°С и ниже. Не допускается полное заполнение флакона. Не допускается размораживание при хранении и транспортировке.

Будет использоваться единая система маркировки образцов, состоящая из трех цифр, из которых первая обозначает год, вторая – серию, третья — порядковый номер образца в этой серии. Номера серий определяет руководитель программы перед началом полевых исследований. Для каждой серии образцов будет составляться отдельная таблица с возможно более полным их описанием.

За сбор данных отвечают секретарь программы А.А. Перевалова и руководитель исследованиями в рамках гражданской науки А.Р. Строева. Помимо таблиц с характеристиками образцов и информации о местах их хранения, ответственные лица ежемесячно вносят в базы данных сведения о проведенных с образцами исследованиях и ссылки на полученные результаты.